中国科学院战略性先导科技专项(B类)

土壤-微生物系统功能及其调控

项目 - 课题1:土壤微生物单细胞筛选的新技术及应用

课题1:土壤微生物单细胞筛选的新技术及应用

核心科学技术问题:

  1. 如何克服“难培养微生物”技术难点,高效识别土壤中发挥特定功能的细胞和关键功能基因?
  2. 如何优化土壤微生物优化培养条件,将特定的微生物类群和功能微生物进行富集培养,从而获得单细胞活体土壤微生物,并将“难培养”变为“可培养”微生物? 
  3. 如何突破单细胞水平的基因组和转录组研究难点,实现高灵敏度、高可靠性和高通量的分析与验证?

 

解决问题的思路与方法:

单个活体细胞是土壤微生物群落结构和功能的基本单元,因此,针对单个活体细胞的功能分选和组学分析(单细胞技术)将能够从最“深”的尺度上理解土壤菌群的功能机制。同时,由于单细胞技术在进行活体细胞的表型分析时不依赖于培养,因此能够直接跨越“难培养微生物”这一关键技术难题。基于上述总体思路,本课题通过研发单细胞拉曼分选、单细胞全基因组分析和单细胞高通量培养等创新技术模块,将建立国内外首个集样品预处理、拉曼分选、核酸分析和细胞培养等为一体的“土壤菌群单细胞功能基因组技术体系”,并以平台方式服务于本专项。具体方法包括:(a)在总体方案方面:集土壤样品预处理、单细胞拉曼分选、单细胞DNA/RNA分析、单细胞培养等功能为一体,拓展与现有二代测序仪的无缝功能耦合模块,实现微生物细胞识别、分选、解析和改造利用的一体化流程;(b)在单细胞拉曼分选技术模块方面:通过建立典型土壤微生物的拉曼数据库,通过拉曼激活单细胞微流与弹射的结合运用,实现特定代谢和生理功能的土壤单细胞分选。(c)在单细胞核酸分析技术模块方面:本方案研制的单细胞测序文库制备芯片,通过细胞裂解、核酸提取、核酸扩增的芯片集成,以及微液滴包裹技术,将有效解决微生物单细胞分析中微量样品吸附、扩散和交叉污染问题。(d)在单细胞培养技术模块方面:通过设计构建单细胞捕获、梯度/等度进样、高通量培养等多功能于一体的微流控芯片模块,将大幅提高单细胞培养通量,实现单个细胞水平、无需标记的土壤微生物种质资源筛选。

 

技术路线:

通过研发单细胞拉曼分选、单细胞全基因组分析和单细胞高通量培养等创新技术模块,将建立国内外首个集样品预处理、拉曼分选、核酸分析和细胞培养等为一体的“土壤菌群单细胞功能基因组技术体系”,并以平台方式服务于本专项,总体技术路线如图所示。

 

主要研究内容

1. 土壤单细胞拉曼分析和分选技术针对土壤菌群的改进

针对土壤环境复杂、含有大量的有机物等化学物质、生物多样性高等特点,采取梯度密度离心等方法对土壤样品进行预处理以对其中目标微生物进行富集及分散,有利于后期拉曼信号采集;通过对仪器改进,实现细胞拉曼信号的快速采集,以实现高通量测量及分选;开发基于微流控或弹射芯片的分选技术,实现快速的单细胞水平的基于拉曼或荧光的高通量分选,以适应土壤等复杂体系。

2. 土壤单细胞功能基因组分析技术的开发

通过开发微流控设备以实现单细胞微液滴包裹及在线电裂解和化学裂解,高通量单细胞PCR微液滴生成,微液滴芯片RNA RT-PCR扩增和DNA全基因组多重置换扩增(Multiple displacement amplification, MDA)等。具体包括通过耦合脉冲电裂解和化学裂解技术实现单细胞高效率在线裂解;改进芯片的流体力学设计,实现单细胞裂解液与扩增所需试剂的在线混合以及微液滴的高通量生成;采用微阀技术实现DNA与RNA分析的功能切换;设计和加工芯片微加热器及控温电路和控制软件,实现DNA/RNA 扩增温度控制。

3. 土壤单细胞高通量培养技术

建立和完善液滴阵列化培养平台,实现大批量微生物单细胞的分离培养。将待分离的细胞样本注入到微流控装置中,生成油相包裹的纳升级单细胞包裹液滴。液滴内分离包裹的单细胞可以实现无交叉污染的细胞繁殖,通过微流控筛选技术,将无细菌生长、少量分裂生长和大量细菌生长的液滴进行分别提取;针对缓慢生长细菌的液滴进行收集和阵列化,进一步培养,以期获得微菌落后进行表征和研究,并开展是否具有应用潜力的考察。在得到稀有微生物培养菌落后,进行进一步的拉曼光谱筛选鉴定和单细胞测序分析。

4. 难培养土壤微生物的富集和分离技术

通过模拟微生物原位生长环境、寻找并添加促生长因子、改进培养方法等提高难培养土壤微生物的可培养性,发展和完善增进微生物可培养性的技术,如单细胞微球包埋技术(GMDs)、原位培养技术(In situ cultivation)、浓缩-驯化培养(FAM)及培养基改进(添加生长因子)等,实现有效的微生物细胞与环境的分离,并获取难培养微生物的纯培养。

5. 技术流程的整合与通量化

主要针对技术体系各环节和各模块的耦合与同步化,各种样品类型的针对性设计和对接等核心问题,并通过核心模块之间参数的整体优化,并进行性能调试;此外,实现与SIP等技术的对接与耦合。

6. 推动此技术平台在专项内的验证和应用

主要将针对碳、氮、磷代谢等研究模式,将高通量单细胞筛选与培养技术应用于专项中其他项目及课题的生物学问题分析,合作建立评价体系与应用示范。

 

方向设置与团队分工:

本课题设置一个子课题。

子课题1:土壤微生物单细胞筛选的新技术及应用,负责人为中国科学院南京土壤研究所仲君研究员和徐健研究员。

 

年度目标:

年度 年度目标
2014 课题调研、具体方案设计、完善试验条件。根据土壤样品特性开发出高效预处理手段,以实现土壤中目标微生物的拉曼信号采集。
2015 完善拉曼激活单细胞分选仪(RACS),实现基于微流控或弹射芯片的高通量细胞分选。通过与SIP、FACS等技术的对接和耦合,构建土壤菌群研究的创新技术体系。
2016 对分选所得细胞进行在线基因组分析和并行化单细胞培养。
2017 通过与本专项中其它项目及课题的结合,将该技术应用于专项具体问题如碳、氮、磷等代谢研究,对目标微生物进行筛选和鉴定,并进行后续基因组分析或培养等。
2018 优化和改进高通量筛选及单细胞培养技术,在领域内推广应用,合作建立评价体系与应用示范。
五年成果
具体体现
(1)建立国内外首个集样品预处理、单细胞拉曼分选、单细胞DNA/RNA分析、单细胞培养等的一体化“土壤菌群单细胞功能基因组技术体系”,完成在国内外5~10个实验室的验证和推广示范,合作建立针对特定土壤研究应用的技术标准,服务本专项研究。(2)与本项目课题一合作,实现SAIS-Soil 与SIP、FACS等技术的对接和耦合,构建土壤菌群研究的创新技术体系(如SIP-RACS、Raman-SIP、FRACS等)。(3)建立首个单细胞尺度土壤模式菌群的碳、氮、磷代谢模型。围绕上述三个目标,课题将合作发表IF>5论文5-10篇,其中IF>10论文1篇,申请专利6-10项。